ABSTRACT
Tendons are part of the connective tissue that joins muscle to bone. Tendon injuries are a problem, since they have a poor ability to regenerate spontaneously. Alternative treatments involving the injection of local growth factors and gene transfer has been evaluated. Thus, we compared two methods for non-viral gene transfer tendons, using the GFP gene as reporter gene. Methods: Wistar rats had the medial quadriceps tendon exposed and the plasmid was transferred by direct injection or complexed with liposomes. Quantification of GFP in the tendom and in the spleen was evaluated by histological analysis with a fluorescence microscope. Results: gene transfer to the tendon was successfully obtained in both treatments. Lipoplex, as expected, showed the highest efficiency in transducing tenocytes, however we have found GFP expression also in the spleen. Naked DNA also showed fluorescence values above the control group and the signal was limited to the tendom. Discussion: the use of GFP as a reporter gene is a classical approach to evaluate gene transfer efficiency. Non-viral gene transfer methods are safe but show low levels of transduction and transient expression. For tendon repair, however, these characteristics may prove beneficial because a transient expression may be desirable to avoid the risk of adverse effects. GFP distribution in the spleen was probably a result of lipoplexes uptake by cells from the reticular endothelial system. Conclusion: taking into account the distribution of GFP in another tissue when using lipoplex, we believe that naked DNA is a more appropriate way to perform gene transfer to the tendon, ensuring safety, low cost and easy handling
Injúrias no tendão representam um problema, uma vez que estes têm pobre capacidade de regeneração espontânea. Tratamentos envolvendo injeção local de fatores de crescimento e transferência gênica tem sido avaliados. Assim, comparamos dois métodos de transferência gênica não viral para tendões, usando o gene GFP como gene repórter. Métodos: ratos Wistar tiveram a porção medial do tendão quadriciptal exposto e o plasmídeo foi transferido através de injeção direta ou complexado com lipossoma. A quantificação de GFP no tendão e no baço foi avaliada por análise histológica. Resultados: a transferência gênica para o tendão foi obtida com sucesso nos dois tratamentos. Lipoplexo demonstrou maior eficiência na transfecção, porém a presença de GFP foi detectada também no baço. A transfecção com DNA nu demonstrou valores de fluorescência superiores ao grupo controle e o sinal foi limitado ao tendão. Discussão: o uso de GFP como gene repórter é uma abordagem clássica para avaliar a eficiência da transferência de genes. A transferência não-viral é segura embora apresente expressão transiente. Para o reparo do tendão, no entanto, essas características podem ser benéficas, pois uma expressão transiente pode ser desejável para evitar o risco de efeitos adversos. A distribuição de GFP no baço foi provavelmente resultado da absorção dos lipoplexos por células do sistema retículo endotelial. Conclusão: Tendo em conta a distribuição de GFP em outro tecido quando utilizamos lipoplexo, pensamos que o DNA nu é uma forma mais adequada para realizar a transferência de genes para o tendão, garantindo segurança, baixo custo e fácil manuseio
Subject(s)
MedicineABSTRACT
A diarréia neonatal em suínos causada por Escherichia coli produtora de enterotoxinas (ETEC) é responsável por alta mortalidade e baixa taxa de crescimento de leitões. A habilidade de tais cepas causar doença é dependente principalmente da capacidade de E. coli aderir-se a mucosa do intestino delgado, que é mediada por fímbrias. Neste estudo o gene faeC, que codifica a subunidade menor da fímbria de E. coli K88ab, foi clonado no vetor de expressão em eucariotos pcDNA3, associado ou não à seqüência de KozaK. DNA plasmidial das duas versões da vacina foi inoculado em camundongos via intra-muscular, em duas doses, nos dias 0 e 21. Os animais que receberam a vacina de DNA contendo o faeC associado a seqüência de Kozak apresentaram soroconversões significativamente maiores (p<0,05) que os vacinados com pcDNA3/faeC sem a seqüência de Kozak.
ABSTRACT
The neonatal diarrhea in swine caused by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is responsible for high mortality and low growth rate in pigs and it is mainly dependent on the capacity of E. coli to attach to the surface of the small intestine, a property mediated by fimbria. In this study the faeC gene, which codes for the minor fimbrial subunit of E. coli K88ab, was cloned in the eukaryotic expression vector pcDNA3, associated or not to the Kozak sequence. Plasmid DNA of the two versions of the vaccine candidate was inoculated in mice by the intramuscular route, in two doses, at 0 and 21 days. The animals that received the DNA vaccine containing faeC associated to the Kozak sequence presented seroconversion significantly higher (P 0.05) than the one vaccinated with pcDNA3/faeC without the Kozak sequence.
A diarréia neonatal em suínos causada por Escherichia coli produtora de enterotoxinas (ETEC) é responsável por alta mortalidade e baixa taxa de crescimento de leitões. A habilidade de tais cepas causar doença é dependente principalmente da capacidade de E. coli aderir-se a mucosa do intestino delgado, que é mediada por fímbrias. Neste estudo o gene faeC, que codifica a subunidade menor da fímbria de E. coli K88ab, foi clonado no vetor de expressão em eucariotos pcDNA3, associado ou não à seqüência de KozaK. DNA plasmidial das duas versões da vacina foi inoculado em camundongos via intra-muscular, em duas doses, nos dias 0 e 21. Os animais que receberam a vacina de DNA contendo o faeC associado a seqüência de Kozak apresentaram soroconversões significativamente maiores (p 0,05) que os vacinados com pcDNA3/faeC sem a seqüência de Kozak.